简要评述生物恐怖因子检测技术的进展_器材装备论文_慧聪消防网

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【摘要】由于生物恐怖的频发，对生物恐怖因子的快速鉴定和检测技术的要求越来越高，本文对生物传感器、质谱仪、免疫检测、光雷达、生物标志物鉴定等检测技术的进展予以评述。

自从“9·11”事件以后，世界各国都加强了对反恐的科研和投入，美国政府2003年科技反恐资金从2002年的10亿美元增加到30亿美元。在白宫科技政策办公室发布的新财政年度科研预算草案中，下一财政年度计划优先资助的科技领域依其重要性划分为跨部门研究和部门研究两个层次。最重要的跨部门研究共有4大领域，反恐科研排在第1位，在各部门(特别是国防部、卫生部、农业部、能源部等)的科研重点中也都突出了反恐科研。在科技领域，主要从加强对疾病和生物媒介等致病性微生物和毒素的管理以及识别、监测、诊断、开发新疫苗和治疗两方面入手。

检验是抗击生物恐怖战的第一线，利用良好的检验技术可立即诊断蓄意使用生物制剂所致的威胁生命的疾病。通过应用先进的生物传感器、质谱仪、免疫检测、光雷达、生物标志物鉴定、基因扩增和流式细胞计量术等科学技术检验来帮助挽救病人的生命。

一、生物传感器

1、DNA芯片

这种器件的工作原理是将样品中微生物的DNA和已知生物武器中生物战剂的DNA作对比，从而识别生物武器和测定微生物浓度。但现场样品中可能只有几十或几百个微生物分子，对大多检测方法而言数量不够。人们开发了聚合酶连锁反应(PCR)法来复制样品的DNA。此法通过热循环不断复制样品的DNA,当热循环n次后，可得2n个复制品，30个循环可得到10亿个复制品。实际探测一般要做25-40个热循环，大约要lmin。

用PGR法不断复制DNA的同时，产生的DNA复制品也不断和DNA荧光示踪剂相混合。由于每一种示踪剂只和某种特定的微生物DNA相匹配，因而会和它相结合，而不会和其他微生物的DNA相结合。在紫外线的照射下，和DNA结合在一起的示踪剂会发荧光，从而识别出样品中的微生物，再配上光电二极管，就可自动测出DNA的浓度。由于对不同DNA序列使用了各种不同的荧光示踪剂，几个PCR反应能同时平行进行，因而这种测试仪器能识别和测量样品中的多种微生物。这种探潮系统的另一个优点是灵敏度高，在30min内可检测只有10个病菌的样品。

利用近年发展起来的微机电系统(MEMS)技术，将微加热器、微沟槽、微反应室、微阀门、微泵等元件做在芯片上。它能泵进毫升量级的样品，浓缩后被超声，提取出DNA。制作在芯片上的薄膜加热器对DNA进行热循环复制。由于小型化，热循环时间缩短到25s，保证传感器能靠电池工作。美国加里福尼亚向阳谷的Cepheld公司已开发出了称作基因专家的这种生物传感器，包括样品制备装置在内和公文包大小，2001年I1月已开始装备美军。

珠滴阵列计数器(BARC)由线状磁场传感器阵列组成，每个微传感器上涂有和生物武器中微生物基因相匹配的特殊DVA检测剂，当样品中的微生物DNA与检测剂相遇时，它们就会相结合，即样品中的DNA与磁性微珠滴相结合，传感器的电阻就会发生一个虽小但可测出的变化。组成生物传感器的微珠滴数目越多，电阻变化越大。磁传感器数出与样品DNA相结合的珠滴数，就测出了样品中病菌的浓度。哥伦比亚特区诺瓦研究实验室开发的这种传感器能测量64种不同DNA的序列。

2、利用抗体的生物传感器

哺乳动物的免疫系统是很特殊的、它的诸多功能之一是当外来物质，如细菌、病毒人侵时，会产生叫抗体的特殊蛋白质来对抗。利用这种现象可以制作生物传感器。利用抗体的生物传感器不但可探测细菌、病毒，还可探测不含DNA的生物毒素。马里兰州凯瑟斯堡某公司研制的这类传感器，类似家用怀孕测试仪。将抗体涂在固定在塑料支架上的多孔带上，加上样品后，若样品中有病原体(细菌、病毒或生物毒素)，抗体和样品中的病原体发生反应会在多孔带上产生两条彩色线。若样品中无病原体，则多孔带上只有一条彩色线。这种传感器简便易用，已商品化。

加里福尼亚洲LawrenceLivermore国家实验室和得克萨斯州奥斯汀的Luminex公司正在上述传感器的基础上分别开发性能更好的生物传感器。前者在简易传感器上增加流量细胞计、可自动探测病原体浓度。后者由100个彩色编码微球组成，当100个彩色微球和流量细胞计结合时，利用抗体可检测同一样品中的20种病原体。

3、生物组织的生物传感器

利用DNA或抗体的生物传感器，要求使用者具有待探测生物武器中生物战剂的先验知识，基于生物组织的生物传感器没有这方面的要求。许多毒素会触发生物细胞产生反应，而且这此反应能被检测和区分，例如利用微电极测定反应所产生的细胞膜电压变化这就是基于生物组织的生物传感器的理论基础。将哺乳动物的活细胞，例如在实验室中培养的心脏细胞种群带有微电极阵列的装置中，就得到了“听心脏跳动”的生物传感器。当生物毒素进人这种传感器时，细胞表面的细微离子通道开和关会引起细胞膜上毫伏级的电压变化。这个变化可由微电极阵列检测出来。加里福尼亚州斯坦福大学的研究小组，已做出这种生物传感器的样品。与其他类型的生物传感器相比，这种传感器还处于开发的早期。因为在战场上保持活细胞就是一件困难的事。斯坦福大学的研究人员已能使细胞存活数天，但对于远离生物实验室的测试现场，还是远远不够的。

二、质谱仪的生物测试系统

利用两台质谱仪可检测生物战剂的蛋白质。与PCR法类似，也从加热样品开始。含有生物战剂蛋白质的样品在150℃和250℃之间加热，使样品气化后被电子束轰击使其带正电，在电场下加速，并根据荷/质比进行分类，荷/质比也被用来计算样品碎片的重量。这些样品碎片再经过第二台质谱仪，使其分解成它的组份氨基酸。每一种蛋白质碎片都有唯一的氨基酸产出率。该系统可区分非常相近的细菌的混合物，并能探测只有100个病菌的样品。对这种系统的挑战是小型化和数据处理速度，使用计算机和图形匹配算法可提高分析速度。这一系统可在移动情况下对化学和生物战剂进行检测、鉴定和监视。仪器还可以卸开携带，用于飞机和舰船报警。由于观测效能强和体积小，这种质谱仪在应用和机动性能方面优于德制的质谱仪GEMS。例如，GEMS只能测定药物，而新型质谱仪则能检测化学、生物物质、毒素和聚合物。而且它已能鉴别12万多个化合物，选择性要比GEMS高得多。这种仪器在ISs内即可检出任何有威胁的材料，定性和定量检查总共只需2min。

Yao等用MALDI-TOFMS分析了空气样品中委内瑞拉马脑炎病毒的胰蛋白酶降解物。利用六个已测序的病毒基因组数据，计算其理论胰蛋白酶降解的肤图谱，构成数据库。经数据库检索，准确的鉴定了该病毒。使用VNTR(Variablenumbertandemrepeat)技术分析来自佛罗里达州、纽约和华盛顿特区的邮件中的炭疽芽胞杆菌分离株，证实它们是同一来源，这株菌来源于1981年从德克萨斯州死牛中分离出一株菌，该株菌被命名为Ames。连接采样探头自动采集生物战剂气溶胶和化学战剂气溶胶的质谱系统(CBMS)，能够同时检测多种化生战剂，已经装备在BIDS和核化生侦察系统中。

三、免疫检测方法

检验鉴定技术包括常规的分离培养、免疫学技术、核酸分析技术、生物传感器、基因芯片技术的应用和新诊断分子，如肤核酸与适配子的应用。酶免疫检测方法酶免疫法1h内检测炭疽芽抱杆菌保护性杭原(PA)，灵敏度为60ngPA/ml，若采用抗兔血清单克隆抗体，检出下限可达15ngPA/ml。酶联血凝素吸附试验(ELLIA)能用两种外源血凝素偶联物2h左右将炭疽芽抱杆菌与其相近的种如蜡样芽抱杆菌相区分，有良好的特异性。电泳免疫转移印迹(ETTB)可用于检测血清中炭疽芽抱杆菌保护性抗原(PA)的抗体，但对于致死因子(LF)抗体的检测不敏感。对于炭疽芽抱杆菌感染的回溯性诊断均敏感、特异，其特异性EITB高于ELLIA。放射免疫法(RIA)灵敏度高，可测定ng或Pg量、特异性好、样品用量少(O.lml左右)、操作方法易标准化。双抗体夹心法及生物素亲和素系统的引人，既减少了本底干扰，提高了实验灵敏度，又能缩短反应时间，而且可实现自动连续测定。免疫荧光试验(IF)用于炭疽与蜡样芽饱杆菌繁殖体的鉴别表明:IF与其他血清学诊断方法相比优势在于，能检测菌群抗原异质性。为提高其敏感性，采用流式细胞记数仪进行记数。流式细胞术(FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，其特点是测量速度快，最快可在1s内计测数万个细胞，可进行多参数测量，可以对同一个细胞作有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义。化学发光免疫分析的基本原理是将发光剂的衍生物，加到免疫反应体系中，取代放射性同位素、酶、荧光等标记物，最后通过某种仪器测童反应过程中产生光子的多寡，从而推算被测物质的量。ECL一般采用Ru(bpy)、TPA作为氧化还原剂。用ECL检测炭疽芽抱杆菌，敏感性达100个细胞/ml。改进的IFCL与常规IFCL相比，敏感性增加了10倍，敏感性可达到10个细胞/mL。免疫电化学与磁珠免疫荧光法(ECLLA)基于电极表面Ru(hpy)2-3标记抗体与过量TPA反应产生光子的氧化还原反应原理。炭疽芽饱杆菌检测范围为10cfu。用核酸分析技术(PCR)检测生物战剂具有如下优点:特异性强;检测核酸成分比检测活微生物本身危险性小;分析速度快;可以快速灭活标本中的生物战剂，用于核酸分析:PCB后用PAGE-EB电泳和PH传感器检测，不经处理可以检出10的平方个芽抱、加人L阿拉明和邻一氨基甲酸D丝氨酸促进发芽4.5h,煮30min可以检出1个芽抱。

四、光雷达

探测远处云中病原体的一种选择是光雷达。美军Edge-wood研究、工程和开发中心研制的光雷达以相似于雷达的方式工作，用光波代替微波跟踪云。美国新墨西哥州的LosAlamos国家实验室建立了三个系统，每个系统都装备一台发射1.064um、脉冲能量达420mJ的Nd；YAG激光器，用Cas-segrin望远镜收集后向散射，用3mm硅雪崩光二极管探测。还有一个称为短程生物探测系统的光雷达系统灵敏度更高，它用闪光灯抽运Nd:YAG激光的三倍频光(355nm)，用双光栅单色仪精合到光电倍增管探测荧光。研究人员用来自O2分子的拉曼散射来标定系统，该标定水平最终可以使观察者收集到更多有关可疑气悬体云的信息，包括分子的类型和分子是活的还是死的。

五、生物标志物鉴定

脂类是最常见的生物标志物，在某些情况下还可以指示细菌的传染性，如霍乱弧菌脂类结构的变化可以指示细菌由可培养到非可培养的转换，而非可培养菌的感染性也大大降低。考克斯氏体属，土拉弗朗西丝菌属，军团菌属和结核分枝杆菌属细菌有其特殊的脂类，可经PLFA(Phospholipidfatty，acid)分析实现鉴定。用ESI-MS的检测方法研究大肠杆菌和炭疽杆菌的脂肪酸成分经乙醇或次氯酸盐消毒处理后的变化，表明这种方法可以对已消毒的细菌进行鉴定。可移动式热裂解质谱方法对细菌全细胞(约10-20个)与甲基化试剂混合后经热裂解，由毛细石英管导人EI源，质量分析器为离子阱型。测定了鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌、炭疽芽抱杆菌的脂肪酸甲醋。Py-MS采用原位热裂解甲酚化，样品处理只需30s，分析周期仅为10min。而且除脂肪酸外，还检测到了芽饱中的特殊成分DPA的甲酷化衍生物。根据四种生物战剂质谱图中峰位和峰强的不同，极易将它们区分开。通过酸水解把胞壁酸释放放出来，中和多余的酸，再加人一定量的内标，经MS/MS测定可以给出定性定量结果。类似的其它氨基糖也可以用作化学分类的标志物，如军团杆菌属中的异鼠李糖胺和岩藻聚糖胺，半乳糖胺的含量不同可区分炭疽芽袍杆菌和蜡样芽抱杆菌。DPA(吡啶-2,6-二羧酸)是所有细菌芽抱中特有的一种成分，是区分细菌芽抱和繁殖体的标志物。Coodacre等用Py-MS和傅立叶变换红外光谱检测DPA，该方法对26株实验菌株都能正确判定以芽抱还是繁殖体的形式存在。

六、各种检测方法的比较

检测生物战剂的方法较多，生物传感器、生物芯片、质谱、色谱、免疫分析等。各有优缺点，从目前检测技术发展的现状来看细胞芯片方法其分析速度、灵敏度、检测范围等均优于其它方法，结果见附表。

各种检测方法的比较

检测方法微流检测免疫试条PCRPCR芯片细胞芯片生物发光

(细菌)VVVVVV

（病毒）?VVVVV

（毒素）VVV

分析时间<1hr<15min10-60min>liar几秒几分

灵敏菌数>10>1000>5>100>1>500

可靠性中上中强很强中上中下

特异性中上中强很强中上差

设备复杂手持中等复杂中等手持